Protein-Microarrays für die Wirkstoffentwicklung: Herstellung und Charakterisierung eines bakteriellen Hitzeschockproteins (BestMasters) (German Edition)

Emilia Schax beschreibt die Herstellung von Hitzeschockproteinen und die Entwicklung eines direkt-kompetitiven Inhibitor-Screenings für Hitzeschockproteine im Microarray-Format. Dieser Assay liefert in kürzester Zeit mit geringem Materialverbrauch Informationen zu den Bindeeigenschaften potenzieller Inhibitoren, die dann als mögliche Therapeutika dienen könnten. Der Assay basiert auf der Kompetition von fluoreszenzmarkierten ATP mit den potentiellen Inhibitoren um die ATP-Bindetasche der Proteine. Während der Masterarbeit wurden zehn potentielle Inhibitoren, die Geldanamycin- oder Reblastatin-Derivate sind, getestet. Ihre IC50-Werte lagen im Bereich zwischen 0,5 nM und 4 μM. Geleitwort 6 Vorwort 8 Inhaltsverzeichnis 9 Abbildungsverzeichnis 11 Tabellenverzeichnis 13 Abkürzungsverzeichnis 14 1 Einleitung 16 1.1 Zielsetzung 17 2 Theorie 19 2.1 Hitzeschockproteine 19 2.1.1 Evolution der Hitzeschockproteine 20 2.1.2 Genregulation und Genexpression der Hitzeschockproteine 23 2.1.3 Aufbau der Hitzeschockproteine 26 2.1.4 Funktion der Hitzeschockproteine 28 2.2 Helicobacter pylori und sein Hitzeschockprotein HtpG 31 2.3 Hitzeschockproteine als Target zur Krankheitsbekämpfung 33 3 Praktischer Teil 38 3.1 Produktion des Hitzeschockproteins HtpG aus H. pylori 38 3.1.1 Bioinformatische Vorarbeiten 39 3.1.2 Interaktion von HtpG mit anderen Proteinen 44 3.1.3 Klonierungsarbeiten mit HtpG 45 3.1.4 Expression und Aufreinigung von HtpG 51 3.1.5 Zusammenfassung und Diskussion 54 3.2 Direkt-kompetitiver Verdrängungsassay im Protein-Microarray Format 55 3.2.1 Entwicklung des direkt-kompetitiven Verdrängungsassays 56 3.2.2 Screening von Inhibitoren 61 3.2.3 Zusammenfassung und Diskussion 75 4 Zusammenfassung und Ausblick 77 5 Materialien und Methoden 81 5.1 Verbrauchsmaterialien 81 5.2 Geräte 81 5.3 Reagenzien 82 5.4 Reaktionskits 83 5.5 DNA, Enzyme, Marker, Antikörper 84 5.6 Softwaretools 84 5.7 Lösungen und Puffer 85 5.8 Inhibitoren 87 5.9 Polymerase-Kettenreaktion 88 5.10 Agarosegelelektrophorese 89 5.11 Zusammensetzungen der Nährmedien 90 5.12 Ligation 90 5.13 Transformation 90 5.14 Restriktionsenzymverdau 91 5.15 Kultivierung 91 5.16 Zellaufschluss und Proteinaufreinigung 91 5.17 Dialyse und Entfernung des SUMO Fusionsproteins 92 5.18 Polyacrylamid-Gelelektrophorese 92 5.19 Kolloidale Coomassie-Färbung 93 5.20 Semi-dry Western Blot 93 5.21 Direkt-kompetitiver Verdrängungsassay 94 Literaturverzeichnis 96 Anhang 99 Ergänzende Ergebnisse 99 Emilia Schax beschreibt die Herstellung von Hitzeschockproteinen und die Entwicklung eines direkt-kompetitiven Inhibitor-Screenings für Hitzeschockproteine im Microarray-Format. Dieser Assay liefert in kürzester Zeit mit geringem Materialverbrauch Informationen zu den Bindeeigenschaften potenzieller Inhibitoren, die dann als mögliche Therapeutika dienen könnten. Der Assay basiert auf der Kompetition von fluoreszenzmarkierten ATP mit den potentiellen Inhibitoren um die ATP-Bindetasche der Proteine. Während der Masterarbeit wurden zehn potentielle Inhibitoren, die Geldanamycin- oder Reblastatin-Derivate sind, getestet. Ihre IC50-Werte lagen im Bereich zwischen 0,5 nM und 4 æM. Der Inhalt Hitzeschockproteine als Target zur Krankheitsbekämpfung Produktion des Hitzeschockproteins HtpG aus Helicobacter pylori Direkt-kompetitiver Verdrängungsassay im Protein-Microarray-Format Die Zielgruppen Dozierende und Studierende der Chemie, Biochemie, Pharmazie und Medizin Praktiker in der Pharmazeutischen Industrie und im Drug Development Die Autorin Emilia Schax promoviert seit 2013 am Institut für Technische Chemie der Leibniz Universität Hannover und beschäftigt sich mit der Aptamer- und Microarray-Technologie Emilia Schax beschreibt die Herstellung von Hitzeschockproteinen und die Entwicklung eines direkt-kompetitiven Inhibitor-Screenings f©ơr Hitzeschockproteine im Microarray-Format. Dieser Assay liefert in k©ơrzester Zeit mit geringem Materialverbrauch Informationen zu den Bindeeigenschaften potenzieller Inhibitoren, die dann als m©œgliche Therapeutika dienen k©œnnten. Der Assay basiert auf der Kompetition von fluoreszenzmarkierten ATP mit den potentiellen Inhibitoren um die ATP-Bindetasche der Proteine. W©Þhrend der Masterarbeit wurden zehn potentielle Inhibitoren, die Geldanamycin- oder Reblastatin- Emilia Schax beschreibt die Herstellung von Hitzeschockproteinen und die Entwicklung eines direkt-kompetitiven Inhibitor-Screenings fur Hitzeschockproteine im Microarray-Format. Der Assay basiert auf der Kompetition von fluoreszenzmarkierten ATP mit den potentiellen Inhibitoren um die ATP-Bindetasche der Proteine. Front Matter....Pages I-XVI Einleitung....Pages 1-3 Theorie....Pages 5-23 Praktischer Teil....Pages 25-63 Zusammenfassung und Ausblick....Pages 65-68 Materialien und Methoden....Pages 69-83 Back Matter....Pages 85-90