Клеточная инженерия растений: учебное пособие

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ И ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ А. С. ЛУКАТКИН, Е. В. МОКШИН Клеточная инженерия растений УЧЕБНОЕ ПОСОБИЕ САРАНСК УДК 557.21(075.8) ББК Е54 Л 84 Предисловие СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ Конспект лекций 1. Введение в курс «Клеточная инженерия растений» 1.1. Общее представление о клеточной инженерии растений 1.2. Предмет и задачи курса 1.3. Прикладные аспекты клеточной инженерии растений 1.5. Основные термины клеточной инженерии 2.1. Основные этапы развития метода культуры тканей, клеток и изолированных протопластов растений 2.2. Современные направления клеточной инженерии растений 3. Теоретические основы культивирования тканей и клеток высших растений 3.1. Объекты культивирования in vitro 3.2. Культура каллусных клеток 3.3. Культура опухолевых клеток 3.4. Дедифференцировка и каллусогенез 3.5. Механизмы дедифференцировки и каллусогенеза 3.6. Образование каллуса в разных тканях 4. Техника получения каллусной ткани 4.1. Требования асептики при получении культуры in vitro Таблица 1 Стерилизация исходного растительного материала (Бутенко, 1999) 4.2. Питательные среды Таблица 2 Состав некоторых питательных сред, применяемых в фитобиотехнологии 4.3. Требования к физико-химическим условиям 4.4. Работа в ламинар-боксе 5. Типы дифференцировки клеток in vitro 6.1. Поверхностное культивирование каллусных клеток 6.2. Глубинное культивирование клеток высших растений 6.3. Способы регулирования роста суспензионной культуры (М, Мс, N = (ln Xi – ln Xb) / (t, D = S/V, IМ, Мс, N= (Хmax–Х0)/Х0, 6.4. Фазы ростового цикла 6.5. Аппаратура для глубинного культивирования клеток высших растений 6.6. Культивирование отдельных клеток Таблица 3 Влияние «кормящего слоя» на развитие изолированных 7.1. Получение изолированных протопластов Рис. 10. Схема общей процедуры получения растительных протопластов 7.2. Условия выделения и очистка протопластов 7.3. Способы культивирования протопластов 7.4. Условия культивирования протопластов 7.5. Регенерация клеток и растений из протопластов 7.6. Слияние протопластов 7.7. Механизм слияния протопластов 7.8. Использование ИП 8.1. Понятие о соматической гибридизации 8.2. История развития метода соматической гибридизации 8.5. Генетические последствия соматической гибридизации 9.1. Перенос ядер 9.2. Введение хлоропластов 9.3. Реконструирование клеток 9.4. Создание ассоциаций клеток растений и микроорганизмов 10.1. Применение технологий in vitro в практических целях Технологии in vitro в селекции растений (Бутенко, 1999) 10.5. Сомаклональные варианты и мутанты 11. Создание гаплоидов и гомозиготных дигаплоидных линий методами in vitro 11.3. Андрогенез in vitro 11.5. Метод гиногенеза 12. Сохранение in vitro генофонда (коллекции и банки) 12.1. Технологии сохранения генофонда in vitro 12.2. Периодическое субкультивирование 12.3. Криосохранение генофонда 12.4. Техника криосохранения 13. Клональное микроразмножение растений 13.1. Понятие о клональном микроразмножении 13.3. Этапы КМР Процесс адаптации пробирочных растений к почвенным условиям является наиболее проблемной операцией, так как нередко после пересадки растений в почву наблюдаются остановка в росте, опадение листьев и гибель растений. Это связано с тем, что у пробирочны... 14. Получение безвирусного посадочного материала 14.1. Общие представления об оздоровлении растений 14.3. Экономические проблемы КМР и оздоровления растений 15. Получение БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ in vitro посредством клеточных культур 15.2. Вещества, получаемые в культуре клеток Таблица 5 Некоторые экономически важные продукты, синтез которых получен 15.3. Биологические особенности получения БАВ в культуре in vitro 15.5. Примеры получения БАВ в культуре клеток 15.7. Проблемы использования растительных клеток для получения БАВ Таблица 6 Внутриклеточная локализация синтеза и накопления вторичных 15.8. Иммобилизация клеток МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К лекционным ЗАНЯТИЯМ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К лекционным ЗАНЯТИЯМ основное содержание лекционного курса Общее представление о клеточной инженерии растений. Предмет и задачи курса. Прикладные аспекты клеточной инженерии растений. Области применения метода культуры клеток и тканей. Основные термины клеточной инженерии. 2. История и перспективы клеточной инженерии. Требования асептики при получении культуры in vitro. Питательные среды. Требования к физико-химическим условиям. Работа в ламинар-боксе. 7. Протопласты как объект биологического конструирования. 8. Гибридизация соматических клеток. Перенос ядер. Введение хлоропластов. Реконструирование клеток. Создание ассоциаций клеток растений и микроорганизмов. 10. Технологии in vitro в селекции растений. 11. Создание гаплоидов и гомозиготных дигаплоидных линий методами in vitro. 12. Сохранение in vitro генофонда (коллекции и банки). 13. Клональное микроразмножение растений. 14. Получение безвирусного посадочного материала. 15. Получение БАВ in vitro посредством клеточных культур. МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ К лабораторным ЗАНЯТИЯМ Раздел I техника культивирования растительного Работа 1. Организация лаборатории клеточной инженерии растений Ход работы Работа 2. Приготовление питательных сред для культивирования Ход работы Ход работы Работа 4. Получение каллусной культуры клеток Работа 5. Субкультивирование каллусов Ход работы Работа 6. Получение суспензионной культуры клеток Ход работы Работа 7. ПОДСЧЕТ ЧИСЛА КЛЕТОК СУСПЕНЗИИ Ход работы 2. Смешайте суспензию с раствором хромовой кислоты. Соотношение объемов зависит от плотности суспензии. Если суспензия только что посажена, можно рекомендовать 1 мл суспензии на 2 мл 20% хромовой кислоты; если суспензия в стационарной фазе – 1 мл с... 4. Мацерируйте клетки с помощью пипетки (обязательно использовать грушу). 6. Залейте камеру смесью суспензии и хромовой кислоты. Используйте пипетку с длинным тонким носиком или капилляр. 7. Подсчитайте клетки в камере Фукса-Розенталя. Сделайте несколько повторностей. 8. Рассчитайте концентрацию клеток по формуле (перед этим обязательно прочитайте описание камеры): Внимательно следите за тем, во сколько раз вы разводили суспензию. Каждая камера имеет свои собственные параметры (площадь под сеткой, глубина, размеры квадратов). Ход работы Е0 – Е 3. Широким капилляром (трубкой), на конце которого надет шланг с резиновой грушей, возьмите каплю прокрашенной суспензии и поместите на предметное стекло. 4. Осторожно, придерживая с краю, накройте суспензию покровным стеклом, которое опускайте на препарат постепенно, чтобы не образовались воздушные пузыри. НИ В КОЕМ СЛУЧАЕ НЕ НАДАВЛИВАЙТЕ НА ПОКРОВНОЕ СТЕКЛО! Излишек жидкости осторожно отберите поло... 5. Под микроскопом просчитайте число живых и мертвых клеток в поле зрения. При этом, чтобы избежать повторного подсчета клеток в одном и том же поле зрения, ПРЕПАРАТ ПРОСМАТРИВАТЬ ЗИГЗАГОМ. Для расчета бе-рется сумма из трех определений – трех п... Раздел III Ход работы фитогормонов Ход работы Раздел IV Работа 11. Введение лилий в культуру in vitro Ход работы Ход работы Ход работы Ход работы Ход работы Работа 16. Микроразмножение орхидей in vitro Ход работы Работа 17. Микроразмножение земляники садовой in vitro Ход работы Работа 18. Получение микроклубней картофеля in vitro Ход работы тематика рефератов по клеточной инженерии Методические указания к написанию реферата 1 Структура реферата 3 Оформление и расположение текста реферата ГЛОССАРИЙ Элиминация – устранение, удаление, исключение (клеток, органелл, временных органов). ТЕСТОВЫЕ ЗАДАНИЯ Тест 1. Теоретические основы культивирования клеток и тканей растений ВАРИАНТ 1 1. Способность соматической клетки полностью реализовать свой потенциал развития называется ... 2. Гормоны, необходимые для каллусогенеза: 3. При культивировании клеток и тканей бобовых растений используют: 4. Стерилизацию питательных сред проводят: 5. Соматический эмбриогенез включает следующие стадии: ВАРИАНТ 2 1. В состав питательных сред обязательно входят: 2. Переход специализированных, неделящихся клеток к пролиферации – ... 3. Соматический эмбриогенез включает следующие стадии: 4. Стерилизацию посуды и инструментов производят: 5. Объекты культивирования: ВАРИАНТ 3 1. Ткань, возникшая путем неорганизованной пролиферации клеток растений или экспланта, называется ... 2. Фенотипическое выражение дифференциальной активности генов: 3. При культивировании пыльников и индукции морфогенеза у однодольных растений используют: 4. Начало дедифференцировки включает: 5. Соматический эмбриогенез включает следующие стадии: ВАРИАНТ 4 1. Процесс образования каллусной ткани на экспланте называется ... 2. Для укоренения побегов после регенерации растений используют. 3. Выращивание живого материала на искусственных питательных средах называется: 4. Часть каллусной ткани, используемая для переноса на свежую питательную среду, – ... 5. Для поверхностной стерилизации растительных объектов пользуются: ВАРИАНТ 5 1. При культивировании единичных протопластов и клеток используют: 2. Применение различных стерилизующих воздействий называется: 3. Каллусогенез свойствен: 4. Образование в каллусе различных тканей носит название: 5. Метод получения изолированных протопластов разработал: Тест 2. Способы культивирования клеток in vitro ВАРИАНТ 1 1. Поверхностное культивирование каллусных клеток осуществляется на: 2. Для получения клеточной суспензии из каллусной ткани применяют несколько пассажей с удалением из питательной среды ионов: 3. Для инициации суспензионной культуры используют следующие соотношения каллусной ткани и питательной среды: 4. Удельная скорость деления клеток равна скорости деградации в следующей стадии ростовой кривой: 5. Для выделения генетически однородной линии клеток используют технику: ВАРИАНТ 2 1. Субкультивирование каллусной ткани рекомендуется проводить в фазе: 2. Для облегчения получения суспензионной культуры из каллусной ткани изменяют соотношение фитогормонов в среде культивирования: 3. Видимый рост клеток инокулюма не наблюдается в следующей стадии ростовой кривой: 4. Для культивирования клеток высших растений в режиме периодического выращивания используют следующую аппаратуру: 5. Стерильное растение с развитой системой корней и побегов, сформировавшихся in vitro, называют: ВАРИАНТ 3 1. Часть суспензионной культуры, используемая для пересадки в свежую среду, называется: 2. Для получения первичной суспензии используют скорость вращения качалки: 3. Для ограничения скорости роста клеточной суспензии в проточной системе питательную среду лимитируют по: 4. Снижение удельной скорости роста клеточной популяции характерно для следующей стадии ростовой кривой: 5. Для получения культуры отдельных клеток из суспензии клеток используют технику: ВАРИАНТ 4 1. Культуры клеток растений, выращиваемые в жидкой питательной среде, называют: 2. Регуляция открытых проточных систем осуществляется по принципу: 3. Максимальная удельная скорость роста клеточной популяции характерна для следующей стадии ростовой кривой: 4. Источниками отдельных клеток могут быть: 5. Ускорение размножения отдельных клеток при действии ткани-«няньки» или кормящего слоя имеет в своей основе действие: ВАРИАНТ 5 1. Для получения клеточной суспензии используют каллусную ткань следующей консистенции: 2. При выращивании суспензионной культуры используются следующие режимы: 3. Постоянная скорость роста клеточной суспензии характерна для следующей стадии ростовой кривой: 4. Преимущества глубинного выращивания клеток высших растений над поверхностным культивированием заключаются в следующем: 5. Для повышения эффективности деления отдельных клеток используют: Тест 3. Изолированные протопласты и соматическая гибридизация ВАРИАНТ 1 1. Плазмолиз необходим при следующем способе выделения протопластов: 2. Хороший выход протопластов из 1 г свежей ткани растений составляет: 3. Слияние протопластов бывает: 4. Растение, полученное при слиянии изолированного протопласта с цитопла-стом, называется: 5. Создание клетки с новыми свойствами на основании отдельных компонентов разных клеток называется: ВАРИАНТ 2 1. При энзиматическом способе выделения протопластов используют следующие ферменты: 2. При выделении протопластов из культур клеток лучше использовать следующую стадию роста: 3. Для облегчения культивирования протопластов в методе платирования применяют следующие разновидности: 4. В изолированный протопласт можно вводить: 5. Введение цитоплазматических генов в изолированный протопласт: ВАРИАНТ 3 1. При выделении протопластов из плодов чаще применяется фермент: 2. Клетки с числом хромосом, кратным X, называются: 3. Оптимальная плотность засева изолированных протопластов составляет: 4. Изолированные протопласты можно использовать в следующих целях: 5. Для создания новых генетических конструкций используют перенос: ВАРИАНТ 4 1. Концентрация осмотического стабилизатора при выделении протопластов составляет: 2. Для очистки протопластов применяются следующие способы: 3. Регенерация растений из протопластов происходит следующими путями: 4. Слияние протопластов состоит из следующих частей: 5. При трансплантации изолированных ядер в протопласты происходит следующее: ВАРИАНТ 5 1. При выделении протопластов используют следующие параметры среды: 2. Клетки с числом хромосом, не кратным X, называются: 3. При культивировании протопластов используют основные методы: 4. Наиболее эффективный способ химического слияния протопластов – с помощью: 5. Растение, полученное при слиянии изолированных протопластов разных видов, называется: Тест 4. Прикладные аспекты клеточной инженерии для селекционного процесса ВАРИАНТ 1 1. Прогамная несовместимость партнеров при отдаленной гибридизации может иметь следующие причины: 2. Для сохранения важного селекционного материала, поврежденного неблагоприятными воздействиями, применяют метод: 3. Процесс возникновения растения из микроспоры или пыльцевого зерна через эмбриогенез либо образование каллуса называется: 4. При селекции клеточной популяции на устойчивость к неблагоприятным факторам используют следующую схему: 5. Сохранение in vitro генофонда возможно следующим образом: ВАРИАНТ 2 1. Постгамная несовместимость партнеров при отдаленной гибридизации может иметь следующие причины: 2. При использовании культуры семяпочек и незрелых зародышей в питательную среду дополнительно добавляют: 3. Процесс возникновения растения из клеток зародышевого мешка называется: 4. Клеточная селекция – это: 5. Для снижения частоты периодического субкультивирования при сохранении генофонда in vitro применяют следующие приемы: ВАРИАНТ 3 1. Прогамная несовместимость партнеров при отдаленной гибридизации может иметь следующие причины: 2. Источниками гаплоидных клеток могут быть: 3. Непрямой андрогенез происходит посредством: 4. Сомаклональные варианты используются в селекционном процессе как: 5. Объекты криосохранения в жидком азоте: ВАРИАНТ 4 1. Постгамная несовместимость партнеров при отдаленной гибридизации может иметь следующие причины: 2. Гаплоидные клетки и растения позволяют получить: 3. Прямой андрогенез происходит посредством: 4. Частота сомаклональных вариаций в популяции клеток превосходит частоту мутаций на: 5. Вещества, которые при замораживании уменьшают повреждение клеток от механического и осмотического стресса, называются: ВАРИАНТ 5 1. Оплодотворение in vitro осуществляется посредством: 2. Метод «бульбозум» у ячменя основан на: 3. Для получения дигаплоидов из гаплоидных растений: 4. Фенотипическое выражение непостоянства геномов растительных клеток называется: 5. Необходимый этап технологии криосохранения in vitro: Тест 5. Практическое использование методов клеточной инженерии растений ВАРИАНТ 1 1. Использование техники in vitro для быстрого неполового размножения растений, идентичных исходному, называется: 2. Минимальный размер экспланта при получении безвирусного посадочного материала составляет: 3. Посредством использования культивируемых растительных клеток получают: 4. Клетки, поддерживаемые в культуре в течение неопределенно долгого времени, называют: ВАРИАНТ 2 1. При клональном размножении можно получить следующее количество растений за год (не менее): 2. Получение безвирусного посадочного материала возможно при использовании следующих технологий: 3. Вторичные метаболиты, получаемые в культуре растительных клеток, содержат: 4. Синтез и накопление вторичных метаболитов в культуре растительных клеток происходит преимущественно в следующих органеллах: ВАРИАНТ 3 1. Посредством клонального размножения можно оздоровить растения от: 2. Микроразмножение растений in vitro достигается посредством: 3. Технику микропрививок используют для оздоровления: 4. Сохранение пула редких и исчезающих растений – продуцентов метаболитов для промышленности достигается посредством: ВАРИАНТ 4 1. Наиболее удобными объектами клонального размножения (сохраняющими генетическую стабильность на всех этапах процесса) являются: 2. Для получения безвирусного посадочного материала используют термотерапию, т.е.: 3. Посредством клеточных культур можно получать: 4. Возможный способ получения метаболитов, продуцируемых растительными клетками: ВАРИАНТ 5 1. На первом этапе клонального размножения в среду для снятия ингибирования роста токсическими веществами добавляют: 2. Для получения безвирусного посадочного материала используют культивирование: 3. Вторичные метаболиты, получаемые в культуре растительных клеток, обычно: 4. Проблемы получения биологически активных веществ в культуре клеток человека и животных включают: ПРИЛОЖЕНИЕ Таблица 1 – Приготовление маточных растворов для среды Мурасиге-Скуга Таблица 2 – Среда Мурасиге-Скуга для клеточных и тканевых культур Таблица 10 – Приготовление маточных растворов для среды Гамборга-Эвелега Таблица 11 – Среда Гамборга-Эвелега Таблица 12 – Приготовление маточных растворов для среды Блейдза Таблица 14 – Среда Блейдза для соматического эмбриогенеза Содержание ЛУКАТКИН Александр Степанович МОКШИН Евгений Владимирович Клеточная инженерия растений Учебное пособие Редактор Р. Н. Бусарова Дизайн обложки Д. В. Елисеевой